Le jeu se déroule en 2183, quelques décennies après la découverte martienne. L'Alliance dispose alors d'une ambassade sur la Citadelle et a entamé de longue date des tractations pour qu'un humain intègre enfin le cercle prestigieux des Spectres, un corps d'agents d'élite au-dessus des lois et n'obéissant qu'au Conseil, l'instance dirigeante suprême de la Citadelle. Un vaisseau spatial expérimental, le Normandy, vient d'être construit pour l'Alliance en coopération avec les Turiens pour tester des nouvelles techniques de camouflage et de furtivité. Le joueur incarne le commandant Shepard alors que le Normandy se dirige vers Eden Prime, une colonie humaine ayant découvert un nouvel artefact prothéen.